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本试剂盒是基于TRIzox改进后的柱式总RNA提取试剂盒，裂解液充分裂解并匀质化样本，采用独特的硅基质膜吸附技术，通过离心吸附柱在高盐状态下高效专一的结合溶液中的RNA，同时最大限度的有效除去蛋白质、无机盐离子及有机杂质等；可从动物组织、植物材料、各种微生物及培养细胞等样品中快速提取总RNA，每次可处理30～50mg组织或5×10⁶细胞，可同时处理多个不同样品。本试剂盒提取得到的RNA可直接应用于RT-PCR、Northern Blot、Dot Blot、体外翻译等实验。

• 纯度高：最大限度除去蛋白质等杂质，提取的RNA可直接用于下游各种实验。
  
• 提取量大：独特的裂解液配方，充分裂解细胞或组织，RNA提取量多至100μg。
  
• 快速：步骤少，操作简单，节省时间。
  
• 兼容性强：适用于多种动植物组织和细胞RNA的提取。

• 预防RNase污染，应注意以下几方面：
  
  • 使用无RNase的塑料制品和枪头，避免交叉污染。
    
  • 玻璃器皿应在使用前于180℃高温下干烤4小时，塑料器皿可在0.5M NaOH中浸泡10分钟，用水彻底冲洗后高压灭菌。
    
  • 配制溶液应使用无RNase的水。
    
  • 操作人员戴一次性口罩和手套，实验过程中要勤换手套。
• 样品应避免反复冻融，否则影响RNA提取得率和质量。
  
• 使用前若发现TRIzox Reagent有沉淀，可置于56℃水浴几分钟，即可溶解。
  
• 第一次使用前应按照试剂瓶标签说明在Buffer RW2中加入无水乙醇。
  
• 所有离心步骤若无特殊说明均在室温下进行，且所有操作步骤动作要迅速。
  
• 若下游实验对DNA非常敏感，建议用DNase I(不含RNase)(货号：WE0213)对RNA进行处理。

• 样品处理
  
  • 植物组织：取新鲜植物组织在液氮中充分研磨或将植物组织剪碎后直接在TRIzox Reagent中迅速研磨，每30～50mg组织加入1mL TRIzox Reagent，混匀。
    注意：样品体积一般不要超过TRIzox Reagent体积的10%。
    
  • 动物组织：取新鲜或-70℃冻存的动物组织尽量剪碎，每30～50mg组织加入1mL TRIzox Reagent，匀浆仪进行匀浆处理。或在液氮中研磨后加入TRIzox Reagent 1mL混匀。
    注意：样品体积一般不要超过TRIzox Reagent体积的10%。
    
  • 单层培养细胞：吸去培养液，可直接在培养板中加入适量TRIzox Reagent（每10cm2面积需要1mL TRIzox Reagent），用取样器反复吹打使细胞裂解。也可用胰蛋白酶处理后，将细胞溶液转移至RNase-Free的离心管中，300×g离心5min，收集细胞沉淀，仔细吸除所有上清，加入TRIzox Reagent 1mL混匀。
    注意：
    ① 收集细胞数量不要超过1×10⁷。
    ② TRIzox Reagent加量根据培养板面积决定，不是由细胞数决定。如果TRIzox Reagent加量不足，可能导致提取的RNA中有DNA污染。
    ③ 收集细胞时一定要将细胞培养液去除干净，否则会导致裂解不完全，造成RNA的产量降低。
    
  • 细胞悬液：离心收集细胞。每5×10⁶～1×10⁷动物、植物和酵母细胞或每10⁷细菌细胞加入1mL TRIzox Reagent。
    注意：
    ① 加入TRIzox Reagent前不要洗涤细胞，以免RNA降解。
    ② 一些酵母和细菌细胞可能需要匀浆仪或液氮研磨处理。
    
  • 血液处理：直接取新鲜的血液，加入3倍体积的TRIzox Reagent（推荐0.25mL全血加入0.75mL TRIzox Reagent），充分振荡混匀。
    
  • 可选步骤：对于蛋白、脂肪、多糖或胞外物质含量高的样品，如肌肉组织、脂肪组织或植物的块茎，可以在匀浆处理后4℃，12000rpm（~13400×g）离心10分钟以除去不溶物质，此时沉淀中含胞外物质、多糖和高分子量的DNA，而RNA存在于上清中。
• 样品中加入TRIzox Reagent后反复吹打几次，使样本充分裂解。室温放置5分钟，使蛋白核酸复合物完全分离。
  
• 以每1mL TRIzox Reagent加入200μL氯仿的比例加入氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15秒，室温放置2分钟。
  
• 4℃ 12000rpm（~13400×g）离心10分钟，此时样品分为三层：红色有机相，中间层和上层无色水相，RNA主要在上层水相中，将上层水相移到一个新的RNase-Free离心管（自备）中。
  
• 在得到的水相溶液中加入等体积的70%乙醇（无RNase水配制），颠倒混匀。
  
• 将上步所得溶液全部加入到已装入收集管的吸附柱RM中。若一次不能加完溶液，可分多次转入。12000rpm离心20秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
  
• 向吸附柱中加入700μL Buffer RW1，12000rpm离心20秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
  
• 向吸附柱中加入500μL Buffer RW2（使用前检查是否已加入无水乙醇），12000rpm离心20秒，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
  
• 重复步骤8。
  
• 12000rpm离心2分钟，倒掉收集管中废液。将吸附柱置于室温数分钟，彻底晾干。
  注意：这一步目的是将吸附柱中残余乙醇去除，乙醇残留会影响后续酶促反应（酶切、PCR等）。
  
• 将吸附柱置于一个新的无RNase离心管中，向吸附柱的中间部位加入30～50μL RNase-Free Water，室温放置1分钟，12000rpm离心1分钟，收集RNA溶液，-70℃保存RNA，防止降解。
  注意：
  ① RNase-Free Wate体积不应小于30μL，体积过小影响回收率。
  ② 如果要提高RNA的产量，可用30～50μL新的RNase-Free Water重复步骤11。
  ③ 如果要提高RNA浓度，可将得到的溶液重新加入到吸附柱中，重复步骤11。